偌重退火循環擴增法

偌重退火循環擴增法( 英語：Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles，縮寫MALBAC) 是一種準線性的全基因組擴增方法。佮非線性抑是講傳統 DNA 擴增方法無仝（佇每一个循環中，複製的 DNA 會當做後壁循環的模板）， MALBAC 利用特殊引子使擴增子具有互補尾溜以形成環狀，防止 DNA 被指數複製。這致使干焦擴增原始基因組 DNA，就按呢減少矣擴增偏差。MALBAC「用佇鳥銃法生有重疊、涵蓋大部份基因組的擴增子」。 為著欲進行後一代的定序，MALBAC 完成了後才閣進行定定規 PCR 進一步擴增。

技術平台

咧進行 MALBAC 進前，需要通過各種方法分離單一个細胞，包括雷射捕著顯微切割、微流體裝置、流式細胞術抑是微量移液，閣必解。MALBAC 單細胞全基因組織需要進行五个循環地磨練、延伸、解鍊佮成環。

MALBAC 引子

MALBAC 的主要優點是 DNA 強欲呈線性擴增。使用專門的引子會當使擴增子形成環，對而防止𪜶佇咧 MALBAC 的後續循環中進一步擴增。遮的引進有三十五个核核酸長，有八个會當變核准酸佮模板互補結合，閣有二十七个共有核准酸。把它有的核酸序列為：GTG AGT GAT GGT TGA GGT AGT GTG GAG。八个會當變核酸佮單鏈基因組 DNA 分子隨機退火結合。一改延伸過，產生干焦佇咧五'尾溜包含共有核酸序列的「半擴增子」。 半擴增子後壁用作另外一輪延伸的模板，然後產生攏總增加，即三'捀佮五'端序列互補的擴增子。

鏈取代

MALBAC 引子具有可變部份，會當隨機結合模會 DNA。這意味著在任何循環的孤一个片段，攏可能有多个引子佮該片段退火結合。DNA 聚合孵，如源自興熱止紅芽孢桿菌的 DNA 聚合孵（Bst 聚合孵）， 會當取代拄著的沿仝一方向延申的另外一條鏈的五'尾溜彼个頂游的鏈。

錯誤率

_ Bst _ DNA 聚合抹的錯誤率是一四分之一鹼基。

實驗工作流程

一 .單細胞分離佮必解–對單細胞中分離出的 pg 級基因組 DNA 片段（十至一百 kb）用作模板。 二 .熔解–佇咧九十四 °C 時，雙鏈 DNA 分子會去熔了成單鏈形式。 三 .磨練–熔了後，反應隨磨練到零 °C，並將 MALBAC 引子添加到反應當中。 四 .延伸–_ Bst _ DNA 聚合孵（大片段）佇咧六十五 °C 會引起會延伸二分鐘，產生半擴增子。 五 .熔解–會反應加熱至九十四 °C，以將半擴增子佮基因組 DNA 枋仔分離。 六 .磨練–反應佇咧零 °C 快速磨消，然後加入相仝的聚合增加合物。MALBAC 引子有效結合半擴增子佮基因組 DNA 模板。 七 .延伸–_ Bst _ DNA 聚合孵（大片段）佇咧六十五 °C 下跤延伸引子二分鐘。佇遮，以半擴增子做模板的擴增做全擴增子，以基因組 DNA 為模枋擴增做半擴增子。 八 .熔去–會反應加熱至九十四 °C 以將擴增子佮模板分離。 九 .循環–對完整的擴增子，三'尾溜序列現在參五'尾溜互補。佇五十八 °C 時，兩爿雜配形成環狀 DNA。這會當防止完整的擴增子佇咧隨後的 MALBAC 循環中用作模板。 十 .重複步數六配九–五輪的 MALBAC 線性擴增循環。 十一 .定規 PCR–MALBAC 產物通過 PCR 進一步擴增。通過使用二十七个定定見核准酸作為引囝，干焦擴增完整的擴增子。

佇咧 PCR 煞的時陣，pg 級的遺傳物質被放大為 mg 級的 DNA，很以進行 DNA 定序。

應用

MALBAC 提供一種對單細胞擴增 DNA 的無偏差方法。這種單細胞定序方法有廣泛的應用，其中真濟猶閣有待開發。MALBAC 可以分析法醫標本、產前遺傳疾病篩查、了解生殖細胞的發育抑是闡明腫瘤的複雜性。佇咧其基礎頂懸，這項技術允准研究人員通過單一个細胞的觀察突變累積的頻率。此外，伊允准檢測細胞內底佮細胞之間的染色體異常佮基因複製作變化（CNV）， 並且進一步幫助檢測致使單核核酸多態性的不常見突變。

MALBAC 佇癌症研究領域有誠濟應用。伊會當用佇檢查腫瘤內底異質性，識別可能予人侵襲性抑是轉移性表型的基因，抑是評估腫瘤產生耐藥性的可能性。MALBAC 的一項開創性應用發表佇二空一二年十二月《科學》期刊上，描述了使用技術測量結腸癌細胞系 SW 四千八百空二的突變率。通過對三个同源結腸癌細胞佮來自無同譜系的無關係結腸癌細胞平行的擴增 DNA 進行定序鑑定矣 SNP，無檢測著假陽性。閣觀察著踮 SNP 中，鋪排-鋪排的發生頻率是足懸的。單個結腸癌細胞的審貝數佮單核抹酸變化的特徵突出了腫瘤內存在的異質性。

MALBAC 被用做一種的檢查生殖細胞之間遺傳多樣性的方法。通過對來自匿名捐贈者的九十九个人類精子細胞的基因組做定序，MALBAC 予人用佇檢查牽涉著單位配子的基因重組事件，來研究基因重組動態佮其對男性無育的意義。此外，佇咧單一間精子內底，MALBAC 識別出重複抑是缺失的染色體，猶閣有可能對生育能力產生負面影響的 SNP 抑是複製數變化。

優點

佮其他的單細胞定序技術比起來，MALBAC 取得真濟重大進展，上重要的是伊會當報告一个人類細胞百分之九十三的基因組。該技術的一寡優勢包括減少擴增偏差佮增加基因組覆蓋率、有需要足少的枋仔 DNA、以及低假陽性佮假陰性突變率。

減少擴增偏差增加基因組覆蓋率

MALBAC 擴增後進行全基因組定序，通過使用預擴增的準線性步減少佮指數 PCR 擴增相關的偏差。MALBAC 利用五个循環的預擴增佮包含二十七个核准酸的共有序列、八个核增加酸的這个可變序列的引子來產生擴增 DNA 片段（擴增子）， 遮的片段會自我成環，防止額外的複製佮交叉雜交。MALBAC 期間，遮的環袂當用做擴增的模板，就按呢減少落來佮 PCR 著著 DNA 片段無齊勻指數擴增產生的相關擴增偏差。MALBAC 予人講是比其他單改的定序方法（譬如講偌重置換擴增，簡稱 MDA）有閣較好的擴增予齊勻。MDA 以指數方式擴增 DNA，致使著偏差。所以，其他單細胞定序方法相關的擴增偏差致使了基因組的低崁率。佮其他單細胞定序方法比起來，佮 MALBAC 相關的偏差減少，使基因組序列崁率增加。

只有需要一个足少的模板 DNA

干焦一个抑是幾點鐘會當用的時陣，MALBAC 來做增加按呢 DNA 並隨後對其進行的定序，親像用於分析血液中篩選出的腫瘤細胞、產前篩查或法醫樣本。啟動該過程只需要少少仔起始枋模（pg 級的 DNA）， 所以講伊是對單個人體細胞進行的定序的理想方法。

假日性、假陰性突變發生率低

單細胞定序通常有足懸的假陰性突變率。假陰性突變率是指未檢測著真正突變的概率，這可能是因為等一个基因擲落來抑是脫落來致使較增加偏近造成的。佮其他的單細胞定序技術比起來，MALBAC 的序列崁齊勻增強矣 SNP 的檢測閣降低等一个基因擲失率。做雜合子的等位基因無法度擴增，致使檢測出「假純合子」時，等位基因擲失率會增加。這可能因為 DNA 模仔濃度低，抑是模板擴增無齊勻致使雜合子的一个等位基因被複製閣較濟。和等位基因搩失率大約是百分之六十五的 MDA 相比並，MALBAC 愛低會濟（大約仔百分之一）。 佮批量的定序相比並，MDA 有百分之四十一的 SNP 檢測效率，而且 MALBAC 有百分之七十六的 SNP 檢測效率。據報導，MALBAC 的假陽性率嘛誠低。MALBAC 產生的假陽性突變主要是由 DNA 聚合隱佇頭一个擴增循環中引入的錯誤造成的，而且佇隨後的循環中進一步複製。通過對源自單個細胞的譜系中的二嬸三个細胞進行定序以驗證 SNP 的存在矣，閣有通過對來自單獨譜系的無關係細胞進行定序來消除定序佮擴增錯誤，會當消除假陽性。

局限

• 因為只有需要少量的模板 DNA，操作者抑是環境對目標 DNA 的汙染可能會去透濫定序結果。
• 為著完全排除假陽性，有必要將細胞定序結果佮對仝一譜系內底的二石三个細胞得著的結果猶閣有來自不相關譜系的細胞進行較。
• 用佇咧擴增的模樣 DNA 的 DNA 聚合領域容易出錯，並且會佇咧 MALBAC 的頭一个循環中引入定序錯誤，錯誤佇後壁的擴增中複製。
• 使用 MALBAC 佇單細胞水平面的基因組崁率不如批量定序統一。雖然 MALBAC 提懸著單細胞定序的檢測效率，但佮批量的定序相比並，伊無法度檢測大約三分之一的 SNP。

外部連結

• Search : MALBAC-NCBI database
• Yikon Genomics : Whole Genome Amplification ( WGA ) and Multiple Annealing and Looping-based Amplification Cycles ( MALBAC )